蛋白质是生命活动重要的执行者，在催化代谢、调节生命活动以及抗击病原保护机体等过程都发挥着重要作用，因而研究蛋白质的调控机制以及作用原理一直是生命科学领域的一大热点。对于各种参与生命活动的生物分子，识别相互作用的蛋白质是至关重要的，生物分子和蛋白质之间的互作类型包括蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)、蛋白质-核酸相互作用(PNIs)和蛋白质-小分子相互作用(PSMIs)三大类，因此需要一种准确性高、特异性强、适用面广的蛋白质互作检测技术。
研究蛋白质-生物分子相互作用的典型方法包括免疫沉淀(IP)，GST-pull-down、蛋白质芯片和亲和纯化质谱法(AP-MS)等。通常，这些方法的结合都是非共价的，因此这些方法适合强度中等但不严格的洗涤，因此容易导致非特异性结果。在此基础上，邻近标记技术（PL）应运而生，如BioID、APEX和PUP-IT是发现分子相互作用的良好工具。然而，这些PL方法不适合发现特异修饰生物分子(例如N6-甲基腺苷(m6A)修饰的RNA)以及小分子的相互作用蛋白，而且难以研究跨膜蛋白的相互作用。
通过结合结核分枝杆菌糖基化途径的基于底物的亲近性标记活性和链霉亲和素(SA)-生物素系统，上海交通大学陶生策教授团队开发了特异性糖基化作为标识报告物(SPIDER，Specific Pupylation as IDEntity Reporter）方法来识别蛋白质-生物分子的相互作用
BioArtMED:陶生策团队开发新型邻近标记分子-蛋白质互作鉴定技术——SPIDER。
SPIDER技术原理（SAm：改造过的链霉亲和素；PafA：结核分枝杆菌类泛素化连接酶；PupE：改造过的结核分枝杆菌类泛素蛋白）
当靶蛋白(Prey)与带有生物素标记的诱饵分子(Bait)发生相互作用时，会同时与偶联了生物素的 SAm-PupE 靠近，在 PafA 酶的催化作用下，PupE 的C末端会与Prey蛋白表面的赖氨酸残基共价相连，从而实现对靶蛋白的捕获。该过程将生物分子与蛋白质之间的非共价结合相互作用转换为SAm-PupE与靶蛋白的共价连接，从而能够稳定地用于后续靶蛋白的富集、鉴定和分析。
SPIDER用于识别m6A结合蛋白（YTDHF1, YTHDF2, YTHDF3和SRSF7）
SPIDER识别膜上受体蛋白（识别H1299、Calu-3和Vero E6细胞表面上SARS-CoV-2 RBD的结合蛋白（包括ACE2 和 Vimentin等））
应用SPIDER技术，研究人员成功鉴定了m6A的结合蛋白以及SARS-CoV-2 刺突蛋白新的膜表面受体。
与传统Pulldown+MS相比，SPIDER+MS具有显著的优势：1) 适用于膜蛋白鉴定，可支持活细胞-诱饵分子结合和检测；2）通用性强，诱饵分子可为蛋白质、抗体、DNA/RNA、小分子等多种类型；3）可检测弱相互作用。此外，SPIDER+MS比其它邻近标记技术亦有诸多优势，详见下表：
SPIDER与其它邻近标记技术的比较
常见问题解答（Q&A）:
1、SPIDER适用场景有哪些？
已知诱饵分子，在混合、复杂样本（包括细胞/组织裂解液、完整细胞等）中鉴定或发现其互作的蛋白质。它是一项体外实验，需要外源加入生物素标记的目的分子，特别地，若诱饵分子是蛋白则需要纯化的重组蛋白，不能是过表达蛋白；若诱饵分子是代谢小分子分子，也需外源加入。
2、是否适用于已知（含假设或推定）的两个互作蛋白进行鉴定？是否能替代Co-IP？
可以应用。需要两个蛋白是重组蛋白，通过SPIDER+WB方式进行鉴定。但不能代替Co-IP，SPIDER+WB是体外实验，Co-IP更接近于天然状态。
3、SPIDER与PLA的区别
PLA（Proximity Ligation Assay）是一项知名的邻近标记方法，基于抗体+标记的核酸序列，常用于鉴定和验证细胞内两个互作蛋白，与Co-IP类似。它不能用于发现新的相互作用，和SPIDER有本质的区别。
4、SPIDER对样本（尤其是核酸）的作用范围是什么？
邻近标记技术都有一个空间作用范围，SPIDER是8 nm。DNA通常标记在末端，太长且是线性结构会使得生物素和结合蛋白距离较远，影响反应效率。不确定的情况下可以尝试，但存在上述风险。
如有需要，请联系我们！
抗码芯瑞联系方式：
电话：021-62202128
400-8868-750
邮箱：info@abcodebio.com
