2025年2月，复旦大学附属中山医院的研究团队在《Hepatology》发表了题为《CAD manipulates tumor intrinsic DHO/UBE4B/NF-κB pathway and fuels macrophage cross-talk, promoting HCC metastasis》的研究，系统解析了嘧啶代谢关键酶CAD在肝细胞癌转移及门静脉癌栓形成中的关键作用。本研究结合多组学分析、代谢示踪及体内外功能实验，对比分析了伴随与不伴随门静脉癌栓的HCC样本，明确发现CAD在高转移性HCC中显著上调，并与侵袭性表型密切相关。在机制研究中，作者创新性地引入SPIDER技术，成功捕获了代谢产物二氢乳清酸（DHO）与泛素连接酶UBE4B之间的直接相互作用，揭示了DHO–UBE4B–JAK1–NF-κB这一此前未知的非经典信号通路。进一步研究表明，该通路一方面诱导肿瘤细胞上皮—间质转化，增强迁移和侵袭能力；另一方面通过促进CSF1分泌，驱动肿瘤相关巨噬细胞向免疫抑制型表型极化，从而协同促进肝癌转移和门静脉内定植。在治疗验证层面，CAD抑制及CSF1R靶向干预在小鼠模型中显著抑制肿瘤进展，提示CAD及其下游信号轴具有明确的转化医学潜力。该研究不仅拓展了人们对肿瘤代谢功能的传统认知，也充分展示了SPIDER技术在解析代谢物—蛋白互作及复杂疾病机制中的独特优势。
研究背景
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是一种高度侵袭性的消化系统恶性肿瘤，其高死亡率主要源于早期缺乏特异性症状以及极强的转移能力。其中，门静脉癌栓（portal vein tumor thrombus，PVTT）是HCC最常见、也是最具挑战性的转移形式之一，显著限制了外科手术及系统治疗的临床获益。长期以来，研究者普遍将肿瘤转移归因于基因突变、信号通路异常及肿瘤微环境改变，而肿瘤代谢更多被视为支持肿瘤增殖的“背景因素”。然而，在临床实践中，即便在分期、病理特征相似的HCC患者中，PVTT的发生风险仍存在显著差异，提示其背后可能潜藏着尚未被充分认识的分子调控机制。受限于传统研究手段，代谢中间产物如何直接参与信号转导、并在肿瘤转移和免疫重塑中发挥作用，长期缺乏系统性证据。
技术路线
1、 核心靶标筛选：多组学数据分析锁定CAD
2、 CAD功能验证：体内外实验确认促转移作用
3、 双重调控机制解析
机制解析（一）：肿瘤细胞内在通路：DHO/UBE4B/JAK1/NF-κB
机制解析（二）：肿瘤微环境（TME）重塑：CAD介导巨噬细胞重编程
4、 临床相关性与泛癌潜力验证
主要结果
本研究围绕肝细胞癌（HCC）转移及门静脉癌栓（PVTT）形成的核心机制，采用“靶标筛选-功能验证-机制解析-临床确证”的系统性技术路线，整合多组学分析、分子生物学、动物模型及临床样本验证等多维度技术手段，层层递进阐明CAD蛋白的调控作用及分子机制，具体如下：
1.多组学整合筛选HCC转移及PVTT形成的核心调控因子CAD
基于159例HCC患者（含37例PVTT阳性）的proteogenomics整合数据（基因组、转录组、蛋白组），通过GSEA算法对比PVTT阳性/阴性样本、肿瘤与癌旁组织的差异富集生物学过程，聚焦嘧啶代谢通路进行差异表达蛋白筛选，结合单因素及多因素Cox回归分析与生存分析，锁定嘧啶代谢关键酶CAD为驱动HCC转移及PVTT形成的核心调控因子，明确其独立预后价值（HR=1.98/1.90，p<0.001）。
FIGURE1 Identification of CAD as the crucial contributor to HCC metastasis.
2.CAD促HCC转移的体内外功能验证
开展体内外功能验证以确认CAD的促转移效应：体外层面，选取高/低转移潜能HCC细胞系（MHCC97H、HCC-LM3、CSQT-2vsHepG2、Huh7），构建CAD过表达（Huh7）及敲低（HCC-LM3、CSQT-2）稳定细胞系，通过Transwell迁移/侵袭实验检测细胞转移能力，Western blot检测上皮间质转化（EMT）标志物表达，并利用CAD特异性抑制剂PALA干预验证效应特异性；体内层面，在裸鼠（HCC-LM3、Huh7）及C57BL/6小鼠（Hepa1-6）中构建皮下移植瘤及原位肝移植瘤模型，通过肿瘤移植、PALA药物干预及组织病理学分析，评估CAD对PVTT形成率、肝内及肺转移灶数量的影响，从细胞和动物水平双重证实CAD的促转移功能。
F I G U R E 2 CAD upregulated in HCC tumor tissues and associated with HCC invasive behavior.
3.肿瘤细胞内在调控机制解析：DHO/UBE4B/JAK1/NF-κB通路
针对肿瘤细胞内在通路，采用LC/MS代谢组学技术检测CAD过表达/敲低细胞的代谢谱差异，结合N15-谷氨酰胺同位素追踪技术动态追踪嘧啶从头合成代谢流向，筛选并验证二氢乳清酸（DHO）为介导CAD促转移的关键代谢产物；进一步通过合成生物素标记DHO探针，应用SPIDER技术（特异性普普化标记身份报告技术）富集细胞裂解液中与DHO直接结合的蛋白，经质谱分析筛选潜在靶点后，通过免疫沉淀（IP）实验确认泛素化因子UBE4B为唯一直接结合蛋白；再通过siRNA敲低UBE4B、体外泛素化实验、Westernblot检测JAK1泛素化水平及NF-κB通路激活标志物（p-P65、P65）与EMT标志物表达，结合NF-κB抑制剂（PDTC）、JAK1抑制剂（Itacitinib）干预验证，完整阐明“CAD→DHO积累→DHO结合UBE4B→促进JAK1泛素化→激活NF-κB通路→诱导EMT”的细胞内在调控通路。
F I G U R E 4 DHO directly bound to UBE4B to promote NF-κB pathway and HCC metastasis.
4.肿瘤微环境重塑机制解析：CAD介导的巨噬细胞重编程
针对肿瘤微环境（TME）重塑机制，对CAD敲低及对照组HCC原位瘤组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），鉴定TME中11类主要细胞类型，通过SCENIC转录调控分析明确肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的3种亚型（Arg1+促肿瘤型、Clec4f+抗瘤型、Dnase1l3+中间型）及其功能属性；构建HCC细胞与巨噬细胞共培养体系，结合转录组数据分析筛选CAD调控的关键细胞因子（CSF1），通过体外实验验证CAD对CSF1分泌的调控作用；体内采用ClodronateLiposomes（非特异性清除巨噬细胞）及PLX3397（CSF1R抑制剂，特异性清除Arg1+TAMs）干预C57BL/6小鼠原位瘤模型，明确CAD通过分泌CSF1诱导Dnase1l3+TAMs向Arg1+促肿瘤型极化，形成免疫抑制微环境的调控模式。
F I G U R E 5 CAD reprogrammed TME macrophage into “protumor” phenotype.
5.CAD的临床相关性与泛癌调控潜力验证
开展临床相关性验证以确证CAD的临床价值：采用qRT-PCR（30例样本）、Westernblot（10例样本）检测HCC肿瘤与癌旁组织中CAD的mRNA及蛋白表达水平，在2个独立HCC队列中通过免疫组化（IHC）分析CAD表达与BCLC分期、TNM分期、PVTT形成等临床病理参数及患者总生存期（OS）、无复发生存期（RFS）的关联；同时利用TCGA（24种癌症）、TCPA公共数据库，分析CAD在不同癌症类型中的肿瘤/正常组织表达差异、预后价值及与NF-κB通路激活的相关性，系统证实CAD的临床相关性及泛癌调控潜力。
研究总结
研究意义：为HCC治疗开辟双靶点新方向
·首次揭示CAD的双重促转移机制：既通过“DHO/UBE4B/JAK1/NF-κB通路”激活肿瘤细胞内在转移潜能，又通过“CSF1介导的巨噬细胞重编程”重塑免疫抑制微环境，二者协同推动HCC转移及PVTT形成；
·SPIDER技术的范式价值：为解析“代谢物-蛋白互作”提供了全新技术工具，破解了传统方法的技术瓶颈；
·明确临床转化潜力：靶向CAD不仅可直接抑制肿瘤细胞转移，还能逆转免疫抑制性TME，为HCC尤其是PVTT患者提供了全新治疗方向，也为泛癌治疗研究提供了新思路。
参考文献
Pan, Jiaomeng, Mao Zhang, Dongning Rao, et al. 2025. ‘CAD Manipulates Tumor Intrinsic DHO/UBE4B/NF-κB Pathway and Fuels Macrophage Cross-Talk, Promoting HCC Metastasis’. Hepatology, ahead of print, March 12. https://doi.org/10.1097/HEP.0000000000001304.
Wong, Carmen Chak-Lui, and Chun-Ming Wong. 2025. ‘CAD-Driven Pathways in HCC Metastasis’. Hepatology, ahead of print, March 18. https://doi.org/10.1097/HEP.0000000000001315.
